С начала 2021 года в НИИ Пастера ищут случаи заражения новыми штаммами коронавируса. За почти три месяца в Петербурге официально не выявили ни одного. При этом специалисты уверены: штаммы уже циркулируют в популяции, а в будущем их будет больше.
«Бумага» поговорила с руководительницей проекта секвенирования генома SARC-CoV-2 Анной Гладких и сотрудницей института Елизаветой Рогачевой о том, как и из-за чего мутирует вирус, почему за долгое время удалось расшифровать не более 200 геномов и как за время пандемии менялись штаммы, распространившиеся на Северо-Западе.
Анна Гладких
руководитель проекта секвенирования генома коронавируса в НИИ Пастера, старший научный сотрудник группы молекулярной генетики патогенных микроорганизмов отдела эпидемиологии
Как мутирует коронавирус и почему до недавнего времени не было слышно о различных штаммах
— Почему вообще появляются новые штаммы?
— Коронавирус [SARC-CoV-2] — это одноцепочечный РНК-вирус. Попадая в клетку, он многократно умножается, чтобы распространиться. У коронавируса нет системы репарации, то есть системы для исправления ошибок в своей собственной нуклеиновой кислоте. В результате многократного умножения происходят изменения последовательности РНК. Они и являются мутациями.
— Как понимаю, таких мутаций достаточно много, но не все они влияют на свойство вируса?
— Да. То, что мы часто слышим о британском, южноафриканском, бразильском, нигерийском штаммах, — это результат их известности. Они считаются наиболее эпидемически опасными, поэтому о них и говорят.
На самом деле других штаммов коронавируса в природе очень много. Но не все они делают вирус более агрессивным или влияют на его распространение. Поэтому об этих штаммах и не говорят.
— Почему одни штаммы влияют на биологию вируса, а другие — нет?
— Нужно сказать, что геном вируса состоит из нескольких генов, кодирующих белки, и некодирующих областей. Если мутация происходит в некодирующей области, то она не влияет на какой-либо белок. Есть ряд мутаций, которые не приводят к изменению кодируемой аминокислоты (так называемые silent mutation), — соответственно, они никак не влияют на производимый ею белок.
Сейчас больше говорят о тех мутациях, которые каким-то образом изменяют характер связи с рецептором клетки человека. Если сродство к рецептору усиливается, то эти штаммы и считают более агрессивными.
— Возможно ли проследить примерную хронологию мутации коронавируса в мире? Почему до конца 2020-го почти ничего не было слышно об этих штаммах?
— Первый штамм коронавируса возник в китайском Ухане в конце 2019 года, именно он стал распространяться по всему миру. При этом уже тогда он начал меняться. Штаммы, которые затем выявлялись в Европе, уже имели точечные мутации. Когда штаммы попали в Россию, они уже были не идентичны первому штамму из Уханя.
Британский вариант выявили в сентябре 2020 года. Сначала о нем накапливалась информация, параллельно он получал распространение в Британии. Британский штамм — один из вариантов коронавируса, в котором сразу возникло очень много мутаций, по сравнению с другими распространенными на тот момент штаммами.
— Корректно ли говорить, что лишь в конце 2020 года появились такие массовые мутации, влияющие на свойства вируса?
— Думаю, к этому времени просто накопилась статистика по секвенированию. Ученые по всему миру стали массово получать эти последовательности и анализировать их.
Почему в Петербурге скорее всего есть британские и южноафриканские штаммы коронавируса, хотя их не находили
Примечание: НИИ Пастера исследует коронавирус на территории Северо-Западного региона. Ученым поступают образцы из 11 субъектов РФ, в том числе Петербурга.
— На Северо-Западе выявляли британские, южноафриканские, бразильские штаммы коронавируса?
— Британских и южноафриканских у нас не выявлено. Пока мы можем сказать, что штаммы Северо-Западного региона неоднородны, есть определенная вариабельность их геномов.
— Как вы думаете, почему так? Это отражает реальную ситуацию?
— Думаю, что на данный момент выявлены не все штаммы, которые реально циркулируют на территории. У нас нет таких мощностей, чтобы стопроцентно секвенировать штаммы от всех пациентов, заболевших коронавирусной инфекцией.
Я полагаю, что интересных штаммов со временем будет выявляться всё больше и больше. Пока нельзя сказать, насколько они распространены, сколько процентов они составляют в структуре заболеваемости. Прошло слишком мало времени.
— А о чем говорит то, что в России выявлено всего несколько десятков британских штаммов из тысяч проанализированных образцов?
— Я не могу делать заявления о том, какова доля британского штамма в общем числе выявленных случаев заболевания коронавируса в России и как они будут распространяться в дальнейшем.
Но то, что их больше, чем выявлено, — это понятно. Потому что охват секвенирования — выборочный. Дальше — больше. Будут ли они дальше распространяться в геометрической или линейной прогрессии — не знаю.
— Как вы думаете, эти штаммы уже присутствуют, например, в Петербурге, хотя их не выявили?
— Вероятно, да. Если они выявлены в других регионах (например, в Москве), то рано или поздно они появятся и у нас в Петербурге, потому что население у нас мобильное: люди путешествуют, ездят в другие страны.
— Известно, изменился ли штамм, который был наиболее распространен на Северо-Западе в начале пандемии?
— Когда первый штамм был выявлен, секвенирование еще масштабно не проводилось. То, что он изменился, — однозначно. Постоянно происходят какие-то мутации.
— Можно сказать, какой сейчас штамм наиболее распространен по Северо-Западу?
— Штаммов много. Точечные мутации возникают. Сказать, что один штамм превалирует, я не могу: это требует дополнительных исследований.
Как происходит расшифровка геномов коронавируса и в чем сложность этого процесса
— Зачем вообще нужно секвенирование ковидных штаммов?
— Секвенирование — расшифровка последовательностей либо части генома, либо полного генома. Оно предоставляет кладезь информации: мы можем узнавать, как устроен геном, сравнивать его с имеющимся геномом, изучать структуру генов, а соответственно, и белков. И, в частности, искать какие-то уникальные генетические события, характерные именно для новых штаммов. На основании расшифрованных последовательностей можно проследить родство штамма, был ли он завезен или он местный.
Я перечислила только некоторые аспекты. На самом деле данные полного генома можно использовать для множества других анализов.
— Какое практическое применение у секвенирования? Могут ли полученные знания помогать эпидемиологам, медикам?
— То, что мы сейчас проводим в НИИ Пастера (как одном из учреждений Роспотребнадзора), — и есть практическое применение. Нам, как и ряду других институтов, было поручено секвенировать и искать известные, считающиеся более опасными штаммы коронавируса.
По факту, мы проводим мониторинг: есть ли в Северо-Западном регионе штаммы британского, южноафриканского и бразильского типов. Конечно, если мы выявим эти штаммы, это поможет медикам и эпидемиологам — они смогут точнее прогнозировать, как будет распространяться вирус, представлять развитие эпидемии и степень вариабельность вируса. Секвенирование также дает понимание биологии вируса, его изменчивости, хода его эволюции.
Мы [в НИИ Пастера] занимаемся этим с начала 2021 года, когда был издан приказ Роспотребнадзора по осуществлению непрерывного мониторинга штаммов SARS-Cov-2 методами секвенирования. Согласно нему мы и проводим нашу работу. В НИИ Пастера мы имеем возможность осуществляем два вида секвенирования: фрагментное (участков генома) и полногеномное. Для этого мы применяем две разные технологии и два разных прибора.
— Давайте проговорим: ваша задача — из 30 тысяч нуклеотидов генома коронавируса найти несколько — один-два знака, — которые отличаются от исходного варианта? Это и есть расшифровка штамма?
— В целом вы правы, но порой их не один-два, а гораздо больше. Геном коронавируса состоит из чуть менее 30 тысяч нуклеотидов. Для британского, южноафриканского, бразильского вариантов известен ряд замен либо делеций (то есть выпадения нуклеотидов) по отношению к референсному штамму. Их мы и ищем в геноме. Нахождение этих замен или делеций говорит о том, что этот штамм принадлежит к тому или иному варианту.
Секвенирование — это сложный, многостадийный процесс, который требует соответствующей квалификации. Нужно внимательно относиться к получаемым данным, чтобы не дать ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Мы не можем расходовать реактивы зря, делая ошибки и набивая шишки. То есть каждый запуск должен быть эффективным.
Полногеномным секвенированием по всему миру — в том числе и в России — занимаются только специалисты высокого уровня, владеющие современными методами молекулярной биологии и хорошо понимающие этот процесс.
Процесс это долгий. Подготовка «библиотек» (фрагментов нуклеиновой кислоты для секвенирования генома), например, занимает несколько дней. Есть протокол, по которому мы работаем: он включает много этапов, много различного оборудования (помимо самого секвенатора). Время полногеномного секвенирования зависит от степени сохранности клинического материала, который к нам поступает. Если он сильно деградирован или из него по какой-то причине сложно амплифицировать геном, то это требует больше времени, чем если материал свежий или хорошей сохранности. То есть время и сложность дополнительных манипуляций варьируется в зависимости от качества материала, и нам приходится варьировать методику практически в каждом случае.
Почему в России расшифровывают меньше геномов коронавируса, чем в Европе
— По последним данным, в России с начала 2021 года расшифровано 9 тысяч геномов коронавируса, из них выявили несколько десятков случаев британского штамма и единицы южноафриканского. Кажется, что это не очень большие цифры.
— Я считаю, что это серьезные цифры. И это то, что опубликовано — а что находится в работе, мы не знаем. Базы постоянно пополняются. Ведь чтобы выявить один британский вариант, нужно обработать сотни образцов.
Расшифровка 9 тысяч геномов — большая работа еще и потому, что, по сравнению с той же Великобританией, наши мощности сиквенсных центров намного меньше. И эти мощности, и количество задействованных специалистов несопоставимы. Так что те цифры по секвенированию, которые мы сейчас имеем — это хороший результат. Будем стремиться к большему.
— Ученые из Дании вообще расшифровывают код вирусов в половине выявленных случаев заражения. Это значит, что в России не хватает мощностей?
— Мне сложно оценить, насколько их не хватает. Могу сказать, что у нас мощности другого порядка, нежели в институтах Европы.
Когда у нас такие задачи возникли, наши мощности — по-возможности — стали очень быстро наращиваться. Мы в институте Пастера делаем всё, что можем.
— Какие мощности в НИИ Пастера? Они отличаются от центров Европы?
— У нас один прибор, который мы используем для полногеномного секвенирования. Полагаю, что в сиквенсных центрах в Европе их десятки. Можно сразу предположить, сколько мы можем получить данных с одного прибора, даже если он будет работать непрерывно. Плюс, как я уже сказала, надо подготовить «библиотеки», сами образцы проанализировать, оценить их качество, подходят ли они для секвенирования, и так далее.
— Подытоживая: основная проблема — нехватка технологических мощностей, а не кадров, например?
— Я говорю за институт Пастера. Но у нас один прибор. Мы делаем максимум из того, что можем делать. Но да, наши мощности значительно уступают.
При этом стоит отметить, что мы научно-исследовательский институт. Наши задачи — не только секвенировать. Хотя на это и брошено много ресурсов.
— Что могло бы дать массовое секвенирование, если бы оно было?
— Чем больше данных, тем лучше. Мы бы лучше понимали, как эпидемия развивается на территории России: сколько у нас собственных штаммов, как изменяется вирус. Плюс лучше бы понимали, как происходят заносы, в том числе повторные. Думаю, это бы позволяло и лучше прогнозировать, как эпидемия будет развиваться дальше.
— Что происходит после того, как вы секвенировали геном? Вы отправляете это в Роспотребнадзор?
— В России сейчас формируется собственная база данных геномов вирусов. Мы ее пополняем своими данными.
— В общемировой дискурс ваша работа как-то вписывается?
— Пока это российская база, она закрыта для мирового сообщества. Будет ли она в открытом доступе или нет, решит руководство Роспотребнадзора.
Какие результаты получил НИИ Пастера с начала 2021-го и кто работает над секвенированием
— В НИИ Пастера было сделано несколько запусков полногеномного секвенирования. Один запуск — это 96 проб.
После запуска, то есть окончания непосредственно секвенирования, мы собираем геномы, смотрим на корректность результата, проводим дальнейший анализ. Если есть какие-либо «дыры», мы «закрываем» их с помощью капиллярного секвенатора. И только после всех тщательных проверок и анализов мы можем нести информацию в массы: говорить, нашли мы что-то необычное или не нашли.
По технологическим мощностям у нас есть всё. Есть любого типа амплификаторы разных производителей, есть достаточно оборудования для выделения РНК и ДНК (даже робот, который выделяет нуклеиновые кислоты).
Вектор развития в нашем институте задают два человека — наш директор Арег Артемович Тотолян и его заместитель по научной части Владимир Георгиевич Дедков. Руками и головой у нас работают Анна Гладких — руководитель этого проекта, а также Ольга Канаева, Валерия Сбарцалья — они занимаются приемом проб, выделением РНК и различными этапами пробоподготовки. Я вместе с ними занимаюсь постановкой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Перед секвенированием мы смотрим, действительно ли положительны образцы, которые нам привезли. Дальше у нас идет большая работа по первичной оценке качества проб, мы ставим ПЦР, затем этап фореза. И только потом мы начинаем пробоподготовку для секвенирования.
Читайте, как петербургский эпидемиолог изучал в Ухане происхождение COVID-19 и что удалось выяснить. Это интервью с участником миссии ВОЗ Владимиром Дедковым.
«Бумага» рассказывала, что антитела к коронавирусу есть у половины жителей Петербурга, это показало исследование. Значит ли, что эпидемия закончилась? Возможна ли третья волна? Читайте интервью с эпидемиологом.
